人白介素10 ELISA試劑盒           

 用途：人IL-10 ELISA試劑盒用于體外定量檢測人血清，血漿，緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液中的白介素10。此試劑盒只用于科研，不能用于診斷。

檢測原理：

IL-10試劑盒應(yīng)用的是夾心法固相酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）。IL-10特異單克隆抗體被包被于微孔板上，已知IL-10濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和未知濃度的樣品可在此反應(yīng)孔中進(jìn)行檢測。先將IL-10抗原和生物素標(biāo)記IL-10特異單克隆抗體同時孵育。洗滌后加入親和素過氧化物酶，孵育后洗去未結(jié)合的酶。其后加入底物，產(chǎn)生顏色反應(yīng)，顏色的深淺與樣品中IL-10的濃度成一定的比例關(guān)系。

試劑盒組成及配制：

自備材料：

蒸餾水；加樣器：10ul, 50ul, 100ul, 200ul, 1000ul; 漩渦振蕩器和磁力攪拌器

保存條件：

試劑盒保存于2-8度，

樣品收集，處理和保存：

1.       細(xì)胞培養(yǎng)上清：1000xg離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

2.       血清——操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000xg離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

3.       EDTA，檸檬酸鹽和肝素血漿可用于檢測。1000Xg離心30分鐘去除顆粒。

4.       如果樣品不直接使用，將其分為小部分（250-500ul）-70℃下保存，避免反復(fù)凍融。

如果可能，不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的顆粒，檢測前先離心或過濾。

注意：不要在37℃或56℃加熱解凍。在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍

實(shí)驗(yàn)方案：

用前所有試劑置于常溫

試劑準(zhǔn)備：

1.  洗滌緩沖液（200x）的稀釋：蒸餾水200倍稀釋成1X的工作液。

2.  標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液液（buffer）：用前用225ml蒸餾水稀釋,稀釋后2-8度可保存一周。

3.  標(biāo)準(zhǔn)品的制備：

基于檢測樣本的不同，試劑盒提供2種不同的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。因?yàn)樯飿颖究赡芎械鞍酌富蚣?xì)胞因子結(jié)合蛋白，可能會修飾檢測的目的蛋白，請按檢測的樣本類型，選擇合適的稀釋液。

血清、血漿樣本：用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液-Human serum

細(xì)胞培養(yǎng)上清：用Standard Diluent Buffer

4.  按標(biāo)準(zhǔn)品瓶上的說明，加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，稀釋后濃度為400pg/ml。溫柔上下顛倒混勻。直接在檢測板上對校準(zhǔn)品做系列稀釋，濃度范圍：400-12.5pg/ml。每次重新做實(shí)驗(yàn)，都需要重新做標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取200ul重懸后的標(biāo)準(zhǔn)品到A1, A2孔（400pg/ml），取100ul標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到B1, B2, C1, C2, D1,D2, E1,E2, F1, F2孔。從A1, A2孔吸取100ul到B1, B2孔，用加樣器反復(fù)吸排使其混合。小心不要擦到孔的內(nèi)表面。同樣從B1, B2孔吸取100ul到C1,C2；再從C1,C2到D1,D2等，從最后的兩個孔（F1, F2）中吸去100ul不要。這樣從A1,A2到F1,F2，IL-10標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的濃度為400pg/ml到12.5pg/ml。也可在試管中進(jìn)行此稀釋，將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品直接加入反應(yīng)孔中。

5.  對照樣本的制備：

對照樣本的稀釋同樣依據(jù)檢測樣本的不同選擇合適的稀釋液，按瓶子上標(biāo)注的加入的稀釋液量加入。

血清、血漿樣本：用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液-Human serum

細(xì)胞培養(yǎng)上清：用Standard Diluent Buffer

6.  生物素標(biāo)記IL-10抗體的制備：

   生物素標(biāo)記抗IL-10的稀釋：每次實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的孔數(shù)，以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋。稀釋量見下表。

7.  親和素-HRP的稀釋：5ul 親和素-HRP加入0.5ml HRP稀釋液, 每次實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備，不要保存此稀釋后液體。根據(jù)反應(yīng)孔的數(shù)量進(jìn)一步稀釋，見下表。

8.   

檢測程序

使用前，將所有試劑充分混合，不要使液體產(chǎn)生泡沫。根據(jù)樣品數(shù)量加上空白，標(biāo)準(zhǔn)品決定所需的板條，每個樣品，標(biāo)準(zhǔn)品，空白和質(zhì)控都應(yīng)做雙份。

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