人sCD95 ELISA 試劑盒用于體外定量檢測(cè)人血清、血漿、緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液中的可溶性

CD95（APO-1, Fas）。本實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)天然的和重組的sCD95。本試劑盒于研究，而非

用于診斷。

sCD95 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）?？箂CD95 特異單克隆抗體包被

微孔板，已知sCD95 濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本、對(duì)照樣本和未知樣本加入微孔進(jìn)行檢測(cè)。

先將sCD95 抗原和生物素標(biāo)記的抗sCD95 特異單克隆抗體同時(shí)孵育。洗滌后，加入親和

素過氧化物酶。再經(jīng)過孵育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入酶復(fù)合物的作用底物，產(chǎn)生

顏色反應(yīng)。顏色的深淺和樣本中sCD95 的濃度呈比例關(guān)系。

 

 

?? 蒸餾水

?? 微量加樣器：10ul,50ul,100ul,200ul,1000ul

?? 旋渦振蕩器和磁力攪拌器

安全性：

?? 僅用于科研

?? 本試驗(yàn)所用的人血成分均經(jīng)檢測(cè)，不含有HbsAg 和抗HIV 陽(yáng)性物質(zhì)。盡管如此，無法

確保沒有傳播肝炎或艾滋病等的可能。因此處理這些血清、血漿樣本時(shí)，應(yīng)該遵守

有關(guān)的安全操作規(guī)程，例如CDC/NIH 健康手冊(cè)：“微生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)試驗(yàn)中的安全”

/1984。

→ 避免硫酸和TMB 與皮膚接觸。如有接觸，可用水*沖洗。

→ 不可在使用試劑盒的地方吃飯、飲水、吸煙或化妝。

→ 不可用口吸取樣本。

1、 使用前應(yīng)根據(jù)標(biāo)簽上指示冷藏。使用時(shí)所有試劑應(yīng)平衡至室溫。凍干標(biāo)準(zhǔn)品使用后

應(yīng)丟棄。

2、 取出所需的孔條后，立即密封包裝，以防變質(zhì)。

3、 不用時(shí)所有試劑要加蓋封好。

4、 不同批號(hào)的試劑不可混用。

5、 過期的試劑不可再用。

6、 使用干凈的吸頭來吸取各種試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照或樣本，以防交叉污染。吸取硫酸

或底物溶液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。

7、 用干凈的塑料容器配備洗滌液。

8、 使用前用振蕩器*混勻各種試劑。

9、 微孔內(nèi)殘留液須充分吸干或在吸水紙上拍干，吸水紙不可插入孔內(nèi)吸水。

10、 TMB溶液是光敏的，避免長(zhǎng)時(shí)光照。避免與金屬接觸產(chǎn)生顏色反應(yīng)。

警告：TMB 有毒，避免手直接接觸，并妥當(dāng)處理。

11、 如配制后幾分鐘產(chǎn)生深蘭色，表明TMB 溶液被污染，必須棄去。在檢測(cè)完成

后一小時(shí)內(nèi)必須讀結(jié)果。

12、 吸取樣本時(shí)，按順序逐孔加樣，以確保孵育時(shí)間相同。

13、 孵育時(shí)間見操作規(guī)程。

14、 在洗滌微孔板之后15 分鐘內(nèi)加入TMB 溶液。

 

1、 細(xì)胞培養(yǎng)上清液——1000xg 離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。

2、 血清——操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液

后，1000xg 離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

3、 血漿——EDTA，檸檬酸鹽和肝素血漿可用于檢測(cè)。1000Xg 離心30 分鐘去除顆粒。

4、 保存——如果樣品不直接使用，將其分為小部分（250-500ul）-70℃下保存，避免

反復(fù)冷凍。如果可能，不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的顆粒，檢測(cè)前

先離心或過濾。

注意：不要在37℃或56℃加熱解凍。在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

1、標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液

蒸餾水10 倍稀釋。

2、標(biāo)準(zhǔn)品

按標(biāo)簽要求以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液配制，其濃度為3000pg/ml sCD95，可儲(chǔ)存。稀釋前輕輕

振蕩此標(biāo)準(zhǔn)品5 分鐘。每次實(shí)驗(yàn)前將此標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋，不能保存。

3、對(duì)照

按標(biāo)簽要求以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液配制。加樣前輕輕振蕩對(duì)照5 分鐘。稀釋后不能儲(chǔ)存。

4、生物素標(biāo)記抗sCD95 的稀釋

生物素標(biāo)記抗sCD95 用生物素標(biāo)記抗體稀釋液根據(jù)使用微孔數(shù)在干凈玻璃管中

稀釋。試驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備。參見下表：

 

 

5、 親和素HRP 的稀釋

在含5ul 親和素HRP 的瓶?jī)?nèi)加入0.5ml HRP 稀釋液。本液為一次性使用。

根據(jù)使用微孔數(shù)在干凈玻璃管中進(jìn)一步稀釋。參見下表：

 

 

6、 洗滌緩沖液的稀釋

蒸餾水200 倍稀釋。

檢測(cè)方法：

1、 試劑用前充分混勻，避免產(chǎn)生泡沫。

2、 確定需要的微孔數(shù)，所有樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、空白和對(duì)照樣本均要做雙份。

3、 加100ul 配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液至標(biāo)準(zhǔn)孔B1,B2,C1,C2,D1,D2,E1,E2,F1,F2。（配制見前

述）吸取200ul 標(biāo)準(zhǔn)品加入A1,A2。（見下表）從A1,A2 中吸取100ul 至B1,B2 孔內(nèi)；

反復(fù)吸排，使之混合。重復(fù)此步驟，從B1,B2 至C1,C2，然后從C1,C2 至D1,D2 等等。

sCD95 標(biāo)準(zhǔn)稀釋液濃度由3000 至93.75pg/ml。從zui后的F1,F2 孔內(nèi)吸取100ul 棄掉。

4、 加100ul 配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液至空白孔G1,G2。

5、 加100ul 樣本至樣本孔和100ul 對(duì)照品至對(duì)照孔H1,H2。

6、 配制生物素標(biāo)記的抗sCD95。（配制見前述）

7、 加50ul 生物素標(biāo)記的抗sCD95 稀釋液于所有孔內(nèi)。

8、 蓋上微孔板，室溫下（18 至25℃）孵育1 小時(shí)。

9、 洗滌微孔板：① 吸去孔內(nèi)液

② 加0.3ml 洗滌液于各孔

③ 再吸去各孔內(nèi)液

④ 重復(fù)②和③二次

10、 僅在用前配制HRP 液。（配制見前述）

11、 加100ulHRP 液于各孔，含空白孔。加蓋。

12、 室溫下孵育0.5 小時(shí)。

13、 洗滌微孔板。（見步驟9）

14、 加100ulTMB 底物液至各孔。室溫下避光孵育20 至30 分鐘。

15、 通常根據(jù)ELISA 閱讀器確定孵育時(shí)間：許多ELISA 閱讀器僅讀數(shù)至2.0 O.D 值。

監(jiān)察O.D 值，應(yīng)在陽(yáng)性結(jié)果衰褪前終止反應(yīng)。（不超過20 分鐘）

16、 酶底物反應(yīng)用100ul 硫酸加入各孔內(nèi)終止。終止反應(yīng)后1 小時(shí)內(nèi)（這段時(shí)間在2

至8℃避光保存）或加入硫酸后立即讀取結(jié)果。

17、 用分光光度儀讀數(shù)，450nm 作為初始波長(zhǎng)，620nm（可以用610 至650nm）作為

參考波長(zhǎng)。

建議微孔板編碼：

 

 

制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，平均光吸收值作Y 軸，對(duì)應(yīng)的sCD95 濃度作X 軸。各樣本中的sCD95

含量可根據(jù)樣本O.D 值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。

本試驗(yàn)的局限性：

超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍（3000pg/ml）時(shí)，不可推測(cè)結(jié)果；樣本必須稀釋后再檢測(cè)。

本試驗(yàn)的檢測(cè)特性：

1、 敏感性：zui小檢測(cè)濃度低于47pg/ml。

2、 準(zhǔn)確性：

 

 

檢測(cè)程序小結(jié)： 總時(shí)間 = 1 小時(shí)45 分鐘

加100ul 樣本或配好的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ?/div>