裴群羽，許媛媛，王 珂，楊立元，楊 磊，雷季良

北京大學醫(yī)學部解剖學教研室，北京市 100083

裴群羽★，女，1980年生，黑龍江省哈爾濱市人，漢族，北京大學醫(yī)學部在讀碩士，主要從事中樞神經(jīng)再生方面研究。
Hxz800829

通訊作者：雷季良, 副教授，北京大學醫(yī)學部解剖學教研室，北京市 100083
leijiliang

中圖分類號:R617
文獻標識碼:A
文章編號:1673-8225
（2007）29-05701-04

收稿日期：2007-01-04
修回日期：2007-04-05
（07-50-1-37/M·A）

Early protection of methylprednisolone to the injured retinal ganglion cells following olfactory ensheathing cell transplantation

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ: To study the early protection provided by methylprednisolone （MP） for injured retinal ganglion cells （RGCs） treated by transplantation of olfactory ensheathing cells （OECs）.
ＭＥＴＨＯＤＳ: The experiment was carried out in the Neuroanatomical Institute of Peking University Health Science Center from September 2005 to September 2006. Seven of fifty-five adult male SD rats were randomly selected as the normal control group and not given any intervention, while the others were the experimental group, in which the optical nerve was exposed from the left supraorbital arch under an operation microscope, then the optic nerve sheaths were cut open in clockwise order, and the optical nerve transected 2 mm from the posterior wall of the eyeball. The experimental group was randomly subdivided into 4 groups with 12 animals in each group: injury group, MP group, which was given intravenous injection of 90 mg/kg MP solution 30 minutes after operation; OECs group, which was transplanted with OEC tissue after operation; MP plus OECs group, which was given the MP solution by the previous method then OECs transplantation. Twenty-one days later, the anesthetized rats of all groups were sacrificed to observe the number of RGCs retrogradely labeled by fluorogold and the expression of heat shock protein 27 （HSP27） in ganglion cell layers by Western blotting, respectively.
ＲＥＳＵＬＴＳ: Fifty-five SD rats were involved in the result analysis. ①The number of RGCs in the MP group exceeded that in the injury group [（16.525±9.557）, （9.889±5.585） cells per field, P < 0.01], that of the MP plus OECs group exceeded that in the MP group and in the OECs group [（28.881±13.660）, （16.525±9.557）, （13.513±6.840） cells per field, P < 0.1, P < 0.01]. ②The expression of HSP27 in the retinal ganglion cells of the MP group was higher than that in the injury group, and that of the MP plus OECs group was more than that of the MP group and OECs group.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ: Early injection of MP could elevate the survival of injured RGCs, and upregulate the expression of HSP27; moreover, it displays the evident protection to the injured RGCs treated by OECs transplantation.

Pei QY, Xu YY, Wang K, Yang LY, Yang L, Lei JL.Early protection of methylprednisolone to the injured retinal ganglion cells following olfactory ensheathing cell transplantation.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2007;11（29）:5701-5704（China）
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-29/29k-5701（ps）.pdf]

摘要
目的：觀察注射甲基強的松龍對嗅鞘細胞移植治療受損視網(wǎng)膜節(jié)細胞的早期保護作用。
方法：實驗于2005－09/2006－09在北京大學醫(yī)學部神經(jīng)解剖實驗室完成。實驗動物分組：成年雄性SD大白鼠55只隨機取出7只為正常對照組，不進行任何實驗處理；其余48只為實驗組，在手術(shù)顯微鏡下經(jīng)動物的左側(cè)眶上緣暴露視神經(jīng)，然后將視神經(jīng)鞘順向劃開，在距眼球后壁2 mm處將視神經(jīng)剪斷。將實驗組動物隨機分成4組，每組12只：①損傷組。②靜脈注射甲基強的松龍組,動物實施術(shù)后30 min給予一次性尾靜脈注射甲基強的松龍注射液（90 mg/kg）。③嗅鞘細胞移植組,動物術(shù)后移植嗅鞘細胞組織層。④給藥后嗅鞘細胞移植組,動物術(shù)后30 min給予一次性尾靜脈注射甲基強的松龍注射液（90 mg/kg），然后移植嗅鞘細胞組織層。術(shù)后21 d麻醉下處死各組大鼠。實驗評估：通過視神經(jīng)逆行熒光標記和蛋白免疫印跡方法觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活狀況以及熱休克蛋白27表達情況。
結(jié)果：55只SD大鼠均進入結(jié)果分析。①視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的存活數(shù)量：甲基強的松龍靜脈注射組高于損傷組[（16.525±9.557），（9.889±5.585）個/視野，P < 0.1]，給藥后嗅鞘細胞移植組明顯高于甲基強的松龍靜脈注射組和嗅鞘細胞移植組 [（28.881±13.660），（16.525±9.557），（13.513±6.840）個/視野，P < 0.1，< 0.01]。②各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞熱休克蛋白27的表達：甲基強的松龍靜脈注射組高于損傷組，給藥后嗅鞘細胞移植組明顯高于甲基強的松龍靜脈注射組和嗅鞘細胞移植組。
結(jié)論：早期注射甲基強的松龍使受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活率升高，并使熱休克蛋白27表達上調(diào)，同時亦表現(xiàn)出了對移植嗅鞘細胞移植治療受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的顯著保護效應。
關鍵詞：甲基強的松龍；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；嗅鞘細胞；早期保護

裴群羽，許媛媛，王珂,楊立元，楊磊，雷季良.甲基強的松龍對嗅鞘細胞移植治療受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的早期保護效應[J].中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（29）:5701-5704 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-29/29k-5701（ps）.pdf]

0 引言

甲基強的松龍現(xiàn)為急性脊髓損傷臨床常規(guī)用藥，但因其長期使用可導致很多不可避免并發(fā)癥，由此產(chǎn)生的不良后果甚至影響了其治療中樞神經(jīng)損傷的效果。為了評價甲基強的松龍的早期治療效果，本實驗擬用甲基強的松龍靜脈注射，觀察其對受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞早期保護作用及對嗅鞘細胞移植治療受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的促進作用。

設計：隨機對照實驗。
單位：北京大學醫(yī)學部解剖學教研室。
材料：實驗于2005－09/2006－09在北京大學醫(yī)學部解剖學教研室完成。成年雄性SD大鼠55只，體質(zhì)量220～240 g，出生0 d SD乳鼠4只，均由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供（合格證號SCXK京2002/0001）。注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（法瑪西亞－普強公司比利時分廠產(chǎn)品），有效成分為甲基強的松龍， 1 mL注射液中含有甲基強的松龍粉末40 mg（稀釋液為苯甲醇－注射用水）。兔抗小鼠Hsp25多克隆抗體（Stressgen Biotechnologies Corporation，Canada的產(chǎn)品）。熒光金（Biotium Corporation，America）。組織裂解液（北京普利萊生物基因技術(shù)有限公司）。A、B發(fā)光底物（北京普利萊生物基因技術(shù)有限公司）。膠片：Kodak X-Omat BT Film（伊士曼柯達公司，美國）。手術(shù)顯微鏡及計算機圖像分析系統(tǒng)（olympus bx51圖像處理系統(tǒng)和dp70圖像處理軟件）。
設計、實施、評估者：實驗由第五作者設計，*、二作者實施，第三、四作者評估。
方法：
動物處理方法：將出生0 d SD乳鼠麻醉、取腦，剝離嗅球，置0.1%磷酸鹽緩沖液中，4 ℃保存?zhèn)溆茫ū緦嶒炛芯鶠橐浦睬? h取嗅球）。復合麻醉劑麻醉成年雄性SD大白鼠，正常對照組（n =7）不做實驗處理；實驗組（n =48）在手術(shù)顯微鏡下經(jīng)動物的左側(cè)眶上緣暴露視神經(jīng)，然后將視神經(jīng)鞘順向劃開，在距眼球后壁2 mm處將視神經(jīng)剪斷，注意不要將走行于視神經(jīng)鞘下方的視網(wǎng)膜中動脈損傷。將實驗組動物隨機分成4組，每組12只： ① 損傷組，動物實施手術(shù)后存活21 d。 ② 靜脈注射甲基強的松龍組，動物實施術(shù)后30 min給予一次性尾靜脈注射甲基強的松龍注射液（90 mg/kg），動物存活21 d。③嗅鞘細胞移植組，動物術(shù)后移植嗅鞘細胞組織層，動物存活21 d。④ 給藥后嗅鞘細胞移植組，動物術(shù)后30 min給予一次性尾靜脈注射甲基強的松龍注射液（90 mg/kg），然后移植嗅鞘細胞組織層，動物存活21 d。
熒光金逆行標記視網(wǎng)膜鋪片：摘取熒光金標記大鼠的左眼，于2%多聚甲醛（0.1 mol/L PB，pH=7.4）中將視網(wǎng)膜從眼球壁上完整剝離，并在每個視網(wǎng)膜的上、下、鼻、顳側(cè)各剪一切口，分成鼻上、鼻下、顳上、顳下四個象限。室溫下將視網(wǎng)膜置于4%多聚甲醛（0.1 mol/L PB）中后固定1 h。然后平鋪于載玻片上，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層朝上，30%甘油封固。
視網(wǎng)膜節(jié)細胞計數(shù)：將熒光金逆行標記視網(wǎng)膜鋪片置于熒光顯微鏡20×物鏡下觀察，以視神經(jīng)盤為中心，在通過視神經(jīng)盤的坐標軸上，分別在視網(wǎng)膜鼻上、鼻下、顳上、顳下4個象限等距（間距為0.5 mm）取點，均取距離視神經(jīng)盤顳側(cè)2 mm處視網(wǎng)膜中被熒光金標記的視網(wǎng)膜節(jié)細胞照像，選擇胞體為圓形或卵圓形，金黃色的熒光金成顆粒狀均勻分布于胞漿和細胞突起起始部的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)。
western blot方法觀察熱休克蛋白27的表達：提取視網(wǎng)膜熱休克蛋白27蛋白,用酶標儀測定蛋白濃度。并繪制標準蛋白曲線。在電泳槽內(nèi)加上1×電泳緩沖液后開始電泳。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜后，加入封閉液和1∶5 000的兔抗小鼠熱休克蛋白27多克隆抗體5 mL（封閉液∶抗體=1∶4）。雜交袋封嚴后，置4 ℃水平搖動過夜。二抗結(jié)合：剪開雜交袋，取出濾膜，用封閉液漂洗3次，每次5　min。將濾膜再放入雜交袋中，封好3面。加入封閉液和1∶3　000辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG。將雜交袋封嚴后，置室溫水平搖動1 h。取出濾膜，用TBS漂洗3次，每次5 min。然后進入暗室，準備好暗盒、膠片及A、B發(fā)光底物。首先在暗盒中鋪入一塊適當大小的保鮮膜，將濾膜向上鋪在保鮮膜上，然后滴上1∶1配比的發(fā)光底物。在濾膜上方再鋪放一層保鮮膜，反應1 min后，將暗室的照明燈關掉，只留下紅外燈照明。在濾膜處的保鮮膜上鋪上膠片，蓋上暗盒，適當時間后，取出膠片，入顯影液、清水、定影液后，用清水沖凈膠片。
主要觀察指標：①視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量。②熱休克蛋白27表達。
統(tǒng)計學分析：由*作者采用SAS 8.01軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗結(jié)果以x ±s表示，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量比較采用配對t檢驗。

2.1 實驗動物數(shù)量分析 實驗動物均進入結(jié)果分析，無缺失。
2.2 熒光金逆行標記法顯示視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量統(tǒng)計 甲基強的松龍靜脈注射組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)為（16.525±9.557）個/視野，明顯高于損傷組[（9.889±5.585）個/視野]，差異有顯著性（P < 0.1）；嗅鞘細胞移植組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)為（13.513±6.840）個/視野，給藥后嗅鞘細胞移植組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的存活數(shù)量進一步提高[（28.881±13.660 ）個/視野]，與嗅鞘細胞移植組比較，差異有非常顯著性（P < 0.01）；給藥后嗅鞘細胞移植組與甲基強的松龍靜脈注射組比較，差異有顯著性（P < 0.1）。見圖1。

 

2.3 western blot法測定熱休克蛋白27表達與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量的關系 21 d時，每組取6只大鼠視神經(jīng)受損側(cè)視網(wǎng)膜、提取蛋白、測定蛋白濃度后，進行電泳。結(jié)果顯示：熱休克蛋白27在代表正常對照組、損傷組、靜脈注射甲基強的松龍組、嗅鞘細胞移植組、給藥后嗅鞘細胞移植組的4個泳道中皆有表達，但以給藥后嗅鞘細胞移植組表達量zui大。靜脈注射甲基強的松龍組、嗅鞘細胞移植組熱休克蛋白27蛋白表達量次之，正常對照組小熱休克蛋白27表達量zui少（圖2）。western blot法測定熱休克蛋白27表達量多時，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量也多。

 

視神經(jīng)受到損傷后，損傷部位發(fā)生炎癥反應是必然的過程，炎癥細胞被激活并釋放多種炎癥遞質(zhì)，在局部炎癥遞質(zhì)的作用下，毛細血管和細靜脈的血流減慢甚至停滯，引起靜脈充血加重水腫，而炎癥的加劇無疑對保護受損視神經(jīng)不利。文獻報道，治療受損中樞神經(jīng)*時機為受損后8 h之內(nèi)[1]，所以施加在早期能發(fā)揮效用的干預手段，即在早期保護受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞,將在一定程度上改善受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞生存微環(huán)境，并為其進一步治療創(chuàng)造有利條件。
甲基強的松龍能夠減輕受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞早期必然發(fā)生的炎癥反應，并改善受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞生存微環(huán)境，為其存活和再生創(chuàng)造條件[2]。Liu 等[3]進行的研究認為，甲基強的松龍通過抑制前列素F的神經(jīng)細胞毒性從而起到對脊髓的膜保護作用。Nash等[4]研究證明, 將脫髓鞘細胞移植到損傷脊髓后再應用甲基強的松龍明顯促進大鼠損傷脊髓的軸突生長。在動物實驗中，甲基強的松龍對脊髓損傷的作用，特別是在傷后1 h內(nèi)注射甲基強的松龍，在減輕脊髓水腫方面明顯優(yōu)于地塞米松組[5]。
在1978、1985、1997 年NASCISⅠ、Ⅱ、Ⅲ[1]進行系統(tǒng)研究后表明：應早期（8 h以內(nèi)）、在脊髓未大片出血壞死之前，大劑量靜脈用藥，結(jié)果顯示可促進中樞神經(jīng)損傷后的恢復。自1982年Anderson等[6]不同的專家將不同劑量的激素（包括甲基強的松龍）用不同的給藥方式和時間治療外傷性視神經(jīng)病變，都取得了積極的治療效果[7，8]。1999 年，Trobe 等[9]研究指出：小劑量口服強地松對視神經(jīng)炎的治療無效，甲基強地松龍大劑量沖擊治療 （2 mg/kg）可加快視力的恢復。同時， 鑒于視神經(jīng)炎多合并多發(fā)性硬化，甲基強地松龍大劑量沖擊治療對預防多發(fā)性硬化的發(fā)生有一定的作用。
1997年Li提出自體移植法修復脊髓損傷的可行性及優(yōu)點。2000年Kato等[10]將從成年人嗅神經(jīng)提取的嗅鞘細胞植入已抑制免疫反應的大鼠脫髓鞘白質(zhì), 結(jié)果表明脫髓鞘神經(jīng)廣泛髓鞘化。嗅鞘細胞移植可能可以用來治療肌萎縮（脊髓） 側(cè)索硬化, 視神經(jīng)損傷。2001年Guntinas等[11]證實嗅鞘細胞移植可以刺激面神經(jīng)損傷的大鼠面神經(jīng)軸突的生長。zui近有人利用豬的嗅鞘細胞移植到非洲綠猿的急性脊髓損傷部位進行異種嗅鞘細胞移植治療靈長類動物急性脊髓損傷獲得成功[12]。雖然以往研究促進視神經(jīng)損傷后再生所采取的嗅鞘細胞移植手段，雖在一定程度上使再生纖維增加，但數(shù)量仍有限[13，14]。分析其原因，可能與損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞迅速死亡、當移植物開始發(fā)揮作用時，絕大多數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞已不可逆轉(zhuǎn)地發(fā)生潰變與凋亡有關。
本實驗在早期給予損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞注射甲基強的松龍，可以延緩細胞的死亡速率，提高細胞生存率。在21 d時給藥后嗅鞘細胞移植組存活視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量多于靜脈注射甲基強的松龍組和嗅鞘細胞移植組，并有統(tǒng)計學意義。對應的western blot法測定熱休克蛋白27的變化與此計數(shù)結(jié)果相一致。熱休克蛋白27在以往的研究報道中顯示具有保護受損中樞神經(jīng)的作用。Yokoyama 等[15]通過鉗夾Wistar 大鼠視神經(jīng)硬膜鞘內(nèi)的眼動脈成功制作了鼠的缺血再灌注損傷模型, 研究神經(jīng)保護因子熱休克蛋白27保護缺血再灌注損傷所誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的發(fā)生。Yokoyama 等[16]將5 μL的外源性熱休克蛋白27 的溶液注入缺血60 min的Wistar 大鼠的玻璃體腔中,再利用電穿孔技術(shù)將熱休克蛋白27 導入視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白27能明顯增強視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞抵御由于缺血再灌注損傷所誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的發(fā)生。
本實驗所用的甲基強的松龍是一種合成的糖皮質(zhì)激素，在本實驗中注射甲基強的松龍后的大鼠，無論在移植嗅鞘細胞之前還是之后，與相應對照組比較熱休克蛋白27皆上調(diào)。甲基強的松龍上調(diào)熱休克蛋白27可能是其保護受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的機制之一。在以往的文獻報道中[17]，其注入血液后通過擴散作用透過細胞膜，并與胞漿內(nèi)甲基強的松龍受體的激素結(jié)合區(qū)結(jié)合，此時作為甲基強的松龍受體分子伴侶的熱休克蛋白90，熱休克蛋白70以及一些小分子蛋白從甲基強的松龍受體解離，然后甲基強的松龍與受體結(jié)合物進入胞核，轉(zhuǎn)錄合成特定蛋白，發(fā)揮其藥理效應，而從甲基強的松龍受體上解離下來的熱休克蛋白，在胞漿發(fā)揮其保護細胞的作用。但至今還沒有報道，甲基強的松龍受體復合物中有熱休克蛋白27的存在，所以甲基強的松龍如何上調(diào)熱休克蛋白27的具體機制需進一步實驗加以證明。
熱休克蛋白27具有保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的能力[18]，在大腦皮質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細胞中熱休克蛋白27的表達可能促進皮質(zhì)神經(jīng)元的存活和出芽再生[19]，都說明了熱休克蛋白27具有中樞神經(jīng)保護作用。本實驗的實驗結(jié)果顯示，甲基強的松龍使受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的存活率升高與熱休克蛋白27上調(diào)趨勢一致，但其中具體的分子機制需要進一步的實驗加以探索。

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