2．在使用*抗體之前，將樣品與過(guò)量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脫脂干奶酪，或來(lái)自于同一寄主的正常血清來(lái)作為標(biāo)記的第二抗體。這個(gè)步驟通過(guò)阻斷*抗體和細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的非特異性的交互作用來(lái)降低背景。

3．在使用*抗體之后，將樣品與5%至10%的來(lái)自于同一寄主的正常血清和作為標(biāo)記的第二抗體一起培育。這個(gè)步驟會(huì)減少不必要的第二抗體與*抗體、細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的交互作用。

通過(guò)用來(lái)自于同樣的樣品的血清稀釋標(biāo)記過(guò)的抗體可以略過(guò)此步驟。此步驟適用于很多方面，但有時(shí)候它也會(huì)導(dǎo)致已標(biāo)記的第二抗體和正常血清中的免疫球蛋白的免疫復(fù)合體的形成。這種復(fù)合體會(huì)優(yōu)先與一些細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)合，或者它們zui終會(huì)導(dǎo)致期望得到的抗體活性的丟失。

4．使用F（ab’）2片段會(huì)使背景決定于*或第二抗體與FC受體的全分子結(jié)合。大多數(shù)的第二抗體的F（ab’）2片段容易利用。而*抗體的F（ab’）2片段一般是不能利用或很難制作。因此，在NaN₃存在的條件下，將新鮮組織或細(xì)胞與正常血清一起培育應(yīng)選擇優(yōu)先加入*抗體。在此情況下，即使在隨后的步驟中用完所有的抗體分子，F(xiàn)C受體決定的背景影響已不再重要。

5．其它：已標(biāo)記的抗體和其他一些內(nèi)在的免疫球蛋白或加入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的其它物質(zhì)的交叉反應(yīng)也可能會(huì)有背景影響。為了降低背景，在多重標(biāo)記過(guò)程中，所有的已標(biāo)記的抗體應(yīng)被吸附，避免其他種類蛋白的交叉反應(yīng)。

 

 

 

隨著研究的進(jìn)展，僅僅對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量和活性的檢測(cè)已不能滿足需要。在單細(xì)胞水平研究細(xì)胞因子的表達(dá)能力對(duì)研究細(xì)胞因子在疾病中的作用越來(lái)越顯的重要無(wú)比。目前檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞特定細(xì)胞因子的表達(dá)手段包括：ELIspot、原位雜交、免疫細(xì)胞化學(xué)、限制性稀釋分析（limiting dilution analysis，LDA）和單細(xì)胞PCR，應(yīng)用原位雜交技術(shù)和免疫組化方法觀察細(xì)胞因子蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)可以識(shí)別Th1和Th2細(xì)胞，此方法可獲得較強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，但此方法工作量大、主觀性強(qiáng)，難以進(jìn)行大樣本檢測(cè)，且人肉眼識(shí)別能力有很大的局限性，而ELISPOT及單細(xì)胞PCR技術(shù)，技術(shù)性強(qiáng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大，難以進(jìn)行廣泛推廣。隨著多標(biāo)記及胞內(nèi)細(xì)胞因子標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)，使對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的研究推向了一個(gè)新的階段。下面主要對(duì)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式細(xì)胞技術(shù)作以介紹。
　　早期細(xì)胞因子表達(dá)與細(xì)胞功能相關(guān)性研究是基于特定克隆細(xì)胞的激活。盡管研究應(yīng)用T淋巴細(xì)胞克隆證明了不同細(xì)胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－?）與TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但這些研究很難外推，因?yàn)門(mén)細(xì)胞克隆與體內(nèi)T細(xì)胞功能相關(guān)性還未被揭示。

近來(lái)，Jung與Picker采用了monensin、PMA等藥物預(yù)孵，用Brefeldin（BFA）、Monensin阻斷了胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)的方法使得細(xì)胞因子聚集，蓄積，增強(qiáng)細(xì)胞因子信號(hào)可被流式細(xì)胞儀檢測(cè)。因?yàn)樽匀粻顟B(tài)下，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生少量的細(xì)胞因子，通常要對(duì)T淋巴細(xì)胞體外活化進(jìn)行研究。在體外刺激過(guò)程中，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子已釋放出來(lái)，胞內(nèi)細(xì)胞因子信號(hào)較弱，難以進(jìn)行檢測(cè)。這一方法可檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)細(xì)胞因子，并可區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群。在細(xì)胞水平該方法證明了人與鼠的淋巴細(xì)胞都存在1型與2型分化，且這些分化在特定細(xì)胞因子增強(qiáng)時(shí)可被逆轉(zhuǎn)。且這些研究清楚地證明，只有激活的細(xì)胞亞群可以表達(dá)細(xì)胞因子，靜止的正常淋巴細(xì)胞（T、B、NK）不能分泌細(xì)胞因子。

胞內(nèi)流式分析法是用抗細(xì)胞因子抗體與細(xì)胞表面或胞內(nèi)特定亞群標(biāo)志組合，即可檢測(cè)不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的分泌，同時(shí)采用特殊的化學(xué)與抗體選擇，確保靜止與無(wú)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的zui小熒光背景。具有其它方法*的優(yōu)點(diǎn)：

Ø         快速：流式定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子可在一天內(nèi)完成，實(shí)驗(yàn)流程需6-8小時(shí)，實(shí)際操作時(shí)間為1-2小時(shí)，快速簡(jiǎn)便；

Ø         簡(jiǎn)便：無(wú)需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無(wú)需分離PBMCs；

Ø         靈敏度高：高度靈敏的熒光標(biāo)記與檢測(cè)系統(tǒng)；

Ø         ：可以在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)檢測(cè)兩種或更多種細(xì)胞因子，也可根據(jù)細(xì)胞免疫表型區(qū)分分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞的亞型，進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)分析；

Ø         安全：減少樣本處理與生物源性污染

Ø         接近生物體的分析條件：全血檢測(cè)保留細(xì)胞及生化微環(huán)境更準(zhǔn)確反映了體內(nèi)狀況。

 

1.         流式上樣管及細(xì)胞培養(yǎng)皿或板

2.         25%CO₂，37℃孵箱

3.         混勻振蕩器

4.         離心機(jī)

5.         加樣器、Tips

6.         流式細(xì)胞儀

 

全血：使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素鋰、EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時(shí)內(nèi)分析，超過(guò)8小時(shí)會(huì)導(dǎo)致活性的損失，一般細(xì)胞因子陽(yáng)性細(xì)胞會(huì)減少5%。如不能在8小時(shí)之內(nèi)檢測(cè)，應(yīng)將真空采血管水平室溫放置。

自身血漿中外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）：使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs，24小時(shí)內(nèi)分析。

組織培養(yǎng)基中的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）：用Ficoll分離PBMCs，將細(xì)胞重懸于含10%熱滅活胎牛血清（FBS）的RPMI－1640培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×10⁶細(xì)胞/ml。

細(xì)胞系與T細(xì)胞克隆：調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度2×10⁶細(xì)胞/mL于新鮮培養(yǎng)基中。

冰凍全血與PBMCs：使用1×紅細(xì)胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重懸，－70℃凍存。溶化后細(xì)胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，離心5分鐘后，用破膜劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破膜和染色。

 

1、細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑

依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇特殊表面標(biāo)志

CD45圈定所有淋巴細(xì)胞
CD3 圈定T淋巴細(xì)胞
CD4 圈定T輔助淋巴細(xì)胞亞群

CD8 圈定T抑制淋巴細(xì)胞亞群
CD19/或CD20圈定B淋巴細(xì)胞
CD56圈定NK淋巴細(xì)胞
CD14圈定單核細(xì)胞

2、熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體：R&D提供FITC、PE和APC標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體

3、溶血素：用外周全血檢測(cè)時(shí)需使用溶血素（R&D目錄號(hào)WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目錄號(hào)00-4333）溶解紅細(xì)胞

4、激活劑

①      Phorbol 12-Myristate 13 Acetate（PMA）（Alexis，目錄號(hào)ALX-445-004-M001）

A. DMSO中調(diào)節(jié)濃度0.1mg/mL

B. 分裝（20?L），－20℃儲(chǔ)存。勿反復(fù)凍融

C.每次實(shí)驗(yàn)用無(wú)菌無(wú)疊氮鈉PBS 1：100稀釋儲(chǔ)存液

D.PMA終濃度25ng/mL細(xì)胞懸液

②      Ionomycin  （Alexis,目錄號(hào)ALX-450-006-M001）

A.       于乙醇中配制成濃度0.5mg/mL

B.       －20℃儲(chǔ)存

C.      每次實(shí)驗(yàn)用無(wú)菌無(wú)疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲(chǔ)存液

D.      Ionomycin終濃度1?g/mL細(xì)胞懸液

③      Staphylococcal enterotoxin B（SEB） （Sigma,Catalog No.S-4881）

A.     無(wú)菌無(wú)疊氮鈉PBS調(diào)節(jié)濃度0.5mg/mL

B.     4℃儲(chǔ)存

C.    SEB終濃度10?g/mL細(xì)胞懸液

④      CD3：包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑存在下活化未稀釋的血液細(xì)胞

⑤      CD28：加速不同刺激劑（包括SEB、CD3等）的活化效應(yīng)，濃度一般為10ug/ml

5、阻斷劑

阻斷高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使得刺激細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子聚集在胞漿內(nèi)

① Brefeldin-A（BFA） （eBioscience，目錄號(hào)00-4506）

A. 于DMSO中調(diào)節(jié)濃度5mg/mL
B. 分裝（20?L），-20℃儲(chǔ)存。勿反復(fù)凍融。
C. 每次實(shí)驗(yàn)用無(wú)菌無(wú)疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲(chǔ)存液
D. 激活zui后4－5小時(shí)BFA終濃度10?g/mL細(xì)胞懸液。

注意：BFA過(guò)度孵育會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降

② Monensin （eBioscience，目錄號(hào)00-4505）

6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640

7、 固定劑：細(xì)胞在體外刺激后需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。固定的目的在于通過(guò)蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細(xì)胞因子固定在細(xì)胞內(nèi)，另一方面避免細(xì)胞表面抗原丟失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目錄號(hào)00-8222）

8、 破膜劑：含1％皂甙、0.05％*的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目錄號(hào)00-8333）

將細(xì)胞膜穿孔，已利于熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，于相應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合

9、其它試劑：無(wú)菌無(wú)疊氮鈉PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃儲(chǔ)存。

 

細(xì)胞活化的zui終結(jié)果是產(chǎn)生細(xì)胞因子，根據(jù)檢測(cè)指標(biāo)和標(biāo)本的不同，研究人員需要選擇不同的刺激劑和刺激時(shí)間，以獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下表提供了檢測(cè)一些常用細(xì)胞因子的推薦的活化方法。

表1、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式檢測(cè)推薦的陽(yáng)性對(duì)照活化方法

為防止細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分泌到胞外，在培養(yǎng)的zui后4-6個(gè)小時(shí)，需要使用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑 （如3uM monensin，10mg/ml的BFA）

方法1:  只使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)

方法2: 人的PBMCs使用PMA （10 ng/ml） 和Ionomycin （1 uM） 刺激4-24 小時(shí).

方法3: 人的PBMC 使用LPS （0.5 - 1 ug/ml） 刺激24 小時(shí).

方法4: 人的PBMCs或者純化的CD4^＋細(xì)胞在包被人CD3抗體的培養(yǎng)板中，使用含有重組人的IL-2（10 ng/ml，目錄號(hào)202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目錄號(hào)204-IL-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；細(xì)胞洗滌后在含有重組人IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2天；zui后收獲細(xì)胞，使用PMA （10 ng/ml） 和Ionomycin （1 uM）刺激6小時(shí)

方法5: CD4⁺ T 細(xì)胞使用PHA （10 ng/ml） 刺激4 days

方法6: T 細(xì)胞使用抗CD3 的單抗、抗CD28的單抗和重組人的IL-1b （Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1）

方法7: 使用PMA （50 ng/ml） 和Ionomycin （500 ng/ml）刺激

方法8: PBMCs細(xì)胞使用重組人IFN? （10 ng/ml，目錄號(hào)285-IF-100） 刺激2 小時(shí)，然后使用IFN? （10 ng/ml） + LPS （1 ug/ml） 刺激22小時(shí)或者使用相同的方法刺激THP-1 細(xì)胞.

方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗體（25 ug/ml） 的培養(yǎng)板中，使用抗CD28 抗體（2 ug/ml） + PMA （5 ng/ml） + Ionomycin （500 ng/ml） 刺激6小時(shí)

方法10: CD4^＋T細(xì)胞在包被小鼠CD3（25 ug/ ml）抗體的培養(yǎng)板中，使用含有抗小鼠的CD28（2 ug/ml）的抗體，重組小鼠的IL-2（10 ng/ml，目錄號(hào)402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目錄號(hào)404-ML-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；然后在含有重組小鼠IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3天；zui后收獲細(xì)胞，使用PMA（5 ng/ml）、Ionomycin（500 ng/ml）和monensin刺激6小時(shí)。

方法11: 小鼠ip巨噬細(xì)胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小時(shí)

方法12: 小鼠脾細(xì)胞使用PMA （5 ng/ml）和Ionomycin （500 ng/ml）刺激6小時(shí)

 

1、   收獲細(xì)胞：肝素鈉抗凝的靜脈血，按1：1與培養(yǎng)基混勻，加刺激劑，同時(shí)加蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（參照說(shuō)明書(shū)）， 混勻后，37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)4-6小時(shí)

①      加適當(dāng)?shù)募?xì)胞表面染色試劑20?L于Falcon管中，加入100?L激活后的全血 （細(xì)胞濃度維持在2×10⁶/mL） 混勻，室溫暗處孵育15分鐘；

②      加入溶血素，室溫暗處孵育10分鐘。（注意：PMA激活的全血可能會(huì)溶血不*。）

③      離心500g 5分鐘，棄上清

①      加固定劑，室溫暗處孵育15分鐘，離心500g 5分鐘，棄上清；

②      加破膜劑溫暗處孵育10分鐘。（劑量參照說(shuō)明書(shū)）

③      加2?3mLPBS洗液，離心500g 5分鐘，棄上清。

5、細(xì)胞內(nèi)染色

①      加入熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體，混勻，室溫暗處孵育30分鐘。

②      加2?3mL洗液，離心500g 5分鐘，棄上清，加入500?LPBS上機(jī)或加入500?L 1% PFA固定后再上機(jī)

 

1.         標(biāo)本處理：避免使用絡(luò)合鈣的抗凝劑，如ACD與EDTA，因?yàn)樗鼈儠?huì)限制鈣依賴性激活過(guò)程，推薦用肝素鈉。此外LPS，一種常見(jiàn)的生物試劑污染物，是強(qiáng)細(xì)胞激活劑，可能會(huì)混淆試驗(yàn)結(jié)果。血樣在8小時(shí)內(nèi)分析，超過(guò)8小時(shí)會(huì)導(dǎo)致活性的損失，一般細(xì)胞因子陽(yáng)性細(xì)胞會(huì)減少5%。如不能在8小時(shí)之內(nèi)檢測(cè)，應(yīng)將真空采血管水平室溫放置。

2.         刺激激活：檢測(cè)不同的細(xì)胞因子根據(jù)情況選擇不同的刺激劑組合和刺激時(shí)間，以保證*的檢測(cè)效果。比如，要檢測(cè)IFN-γ則可選擇PMA和Ionomycin同時(shí)刺激；如果用CD4做表面標(biāo)記，由于多數(shù)病人的CD4抗原會(huì)因PMA的激活而有不同程度的下調(diào)，所以培養(yǎng)時(shí)間不能太長(zhǎng)，4-6小時(shí)為宜，否則CD4下調(diào)影響分析

3.         選擇合適的對(duì)照：為保證結(jié)合的真是和可靠性，至少熒光設(shè)置以下對(duì)照：

①        未刺激對(duì)照：激活時(shí)由于BFA的存在抑制了胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此在激活過(guò)程中產(chǎn)生  的抗原與細(xì)胞因子會(huì)滯留胞內(nèi)，未刺激對(duì)照也應(yīng)包含BFA。

②        激活對(duì)照：激活對(duì)照使用細(xì)胞表面表達(dá)CD69來(lái)評(píng)價(jià)激活與否，如果未達(dá)到CD69期望的水平，則激活步驟出了問(wèn)題，某一試劑可能失活，過(guò)期，制備不當(dāng)或溶劑污染，需制備新鮮刺激劑重新實(shí)驗(yàn)。

③        同型對(duì)照：使用與熒光標(biāo)記抗體相同來(lái)源、相同標(biāo)記、相同劑量和亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。

4.         Fc受體阻斷：使用試劑阻斷Fc受體可以有效減少非特異熒光染色，在小鼠可以用純化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience, 目錄號(hào)14-0161-81），在大鼠可以用純化的抗大鼠的CD32，在人可以用過(guò)量的同種無(wú)關(guān)純化Ig或血清。

5.         熒光素的選擇：檢測(cè)相對(duì)低表達(dá)細(xì)胞因子如IL-4時(shí)，應(yīng)選用PE或APC標(biāo)記；單檢測(cè)某一細(xì)胞因子時(shí)也選用PE或APC標(biāo)記；同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)胞因子時(shí)，弱表達(dá)的應(yīng)選用PE或APC，F(xiàn)ITC標(biāo)記用于高表達(dá)細(xì)胞因子如IFN-γ

 

 

 

 

盡管目前提出了較多的 Th1/Th2細(xì)胞表面標(biāo)志，但根據(jù)淋巴細(xì)胞因子譜的異同識(shí)別Th1和Th2細(xì)胞仍然是目前zui有效的手段，特別是細(xì)胞內(nèi)因子標(biāo)記的流式細(xì)胞技術(shù)。近來(lái)由于細(xì)胞因子ELISA試劑盒的不斷涌現(xiàn)，為研究Th1/Th2細(xì)胞因子譜的變化提供了準(zhǔn)確、可靠、快速的測(cè)定方法。但研究CD4+淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子譜變化時(shí)需要將T淋巴細(xì)胞特異克隆。zui近發(fā)現(xiàn)，在外周血白細(xì)胞中，除CD4淋巴細(xì)胞外，CD8細(xì)胞也存在Th1和Th2樣細(xì)胞因子譜的變化，甚至酸性粒細(xì)胞也具有產(chǎn)生多種細(xì)胞因子的能力，如酸性粒細(xì)胞可分泌IL-4、IL-5、IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα、TGF等。因此單純通過(guò)細(xì)胞因子譜的變化難以有效識(shí)別Th1和Th2細(xì)胞。

根據(jù)T輔助淋巴細(xì)胞（CD4）分泌的細(xì)胞因子譜（cytokine profiles）的不同,將CD4細(xì)胞分為T(mén)h1和Th2亞群。Th1細(xì)胞主要分泌γ-干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）和腫瘤壞死因子-β（TNF-β）,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10及IL-13等因子，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。在多數(shù)免疫反應(yīng)中，T輔助淋巴細(xì)胞并不產(chǎn)生典型的Th1或Th2細(xì)胞和相應(yīng)的細(xì)胞因子，而主要是由Th0細(xì)胞分泌的混合型的細(xì)胞因子。但在疾病的狀態(tài)下，Th0細(xì)胞受特異抗原的刺激時(shí)，一方面向Th1方向發(fā)展，另一方面可能向Th2方向發(fā)展。如在結(jié)核感染轉(zhuǎn)狀態(tài)下可產(chǎn)生Th1和Th2雙向免疫反應(yīng)，在I型超敏反應(yīng)疾病時(shí)主要產(chǎn)生以Th2為主的免疫反應(yīng)。近幾年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2平衡失調(diào)參與多種疾病過(guò)程，如腫瘤免疫、移植免疫及變態(tài)反應(yīng)等，而用流式細(xì)胞儀進(jìn)行Th1/Th2的檢測(cè)克服了傳統(tǒng)方法所得結(jié)果為整個(gè)群體分泌數(shù)值不能區(qū)分單個(gè)細(xì)胞或亞群的反應(yīng)的不足，通過(guò)表面染色多參數(shù)分析可以區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群。一般用CD3⁺/CD4⁺  或CD3⁺/CD8^-作表面標(biāo)記，選擇相應(yīng)的熒光標(biāo)的抗體，Th1和Th2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況如下：

 

全血標(biāo)本經(jīng)過(guò)刺激培養(yǎng)、表面標(biāo)記、固定、破膜、胞內(nèi)染色（IQ，Cytodetect™kit（basic），CAT方法，IQP-367）后結(jié)果如下：

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

一批健康志愿者的全血用PMA+Ionomycin刺激5小時(shí)后，按照操作程序測(cè)得參考值如下：

 

 

 

 

血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板減少癥等疾病的病理生理過(guò)程與血小板相關(guān)。血小板功能檢測(cè)包括黏附、聚集和活化功能試驗(yàn)。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)全血中血小板表面相關(guān)標(biāo)志物是一種新技術(shù)，它拓寬了血小板相關(guān)疾病的診斷與功能研究方法，豐富了血小板功能評(píng)估指標(biāo)。

 

一、流式細(xì)胞儀血小板分析應(yīng)用范圍

1.　通過(guò)分析信號(hào)傳遞、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、顆粒釋放、糖蛋白構(gòu)形、膜磷脂、與抗凝因子的結(jié)合和微粒形成，分析血小板活化，血小板對(duì)刺激物的反應(yīng)性。

2.       通過(guò)分析受激后表面結(jié)合蛋白觸發(fā)凝血鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和表面糖蛋白缺陷檢測(cè)，分析血小板止血功能的獲得性和遺傳性缺陷。

3.       結(jié)合血小板大小，檢測(cè)血小板RNA含量，分析血小板成熟度，計(jì)數(shù)網(wǎng)織血小板。

4.       發(fā)現(xiàn)血小板抗體，做定性和定量分析。

 

1.           血栓性疾病：活化血小板的檢測(cè)能預(yù)測(cè)冠狀血管成形術(shù)后發(fā)生急性缺血事件的危險(xiǎn)性，非風(fēng)濕性心房纖顫患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化，胰島素依賴性糖尿病，子癇前期，外周血管疾病等均可測(cè)出血小板活力增加和（或）循環(huán)中存在活化血小板，而早產(chǎn)兒的血小板對(duì)凝血酶、二磷酸腺苷（ADP）、TXA2的體外激活能力降低。

2.           血小板缺陷性疾?。喝魇郊?xì)胞術(shù)提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、迅速的方法來(lái)診斷血小板膜糖蛋白缺陷性疾病，如巨大血小板綜合征，血小板無(wú)力癥等。前者是由于GPIb-IX復(fù)合物先天缺陷所致的血小板形態(tài)巨大，功能異常的出血性疾病。后者由于GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物先天缺陷，導(dǎo)致血小板聚集功能障礙

3.       貯存池疾?。涸l(fā)性貯存池疾?。?delta;-SPD）常規(guī)用血小板聚集法檢測(cè)，但特異性和靈敏度均不理想。檢測(cè)血小板致密顆粒的阿的平熒光顯微鏡法，主觀性大，操作繁瑣，而且一次檢測(cè)的血小板數(shù)目有限。全血法流式細(xì)胞術(shù)為δ-SPD的診斷提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、迅速的方法，一次能定量檢測(cè)5 000個(gè)以上阿的平染色的血小板。與正常人相比，δ-SPD患者阿的平染色顯著下降（從49%降至15%）。常在骨髓增殖異常綜合征和晚期腎衰中出現(xiàn)的獲得性致密顆粒貯存池疾病，也能用全血法流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)和診斷。

4.           血小板減少性疾?。浩茐倪^(guò)多或生成減少均能導(dǎo)致血小板減少。血小板相關(guān)抗體（PAIg）是反映血小板的破壞的指標(biāo)，雖然其臨床意義仍有爭(zhēng)議。PAIg的檢測(cè)有多種方法，但流式細(xì)胞術(shù)法有其*性。流式細(xì)胞儀能測(cè)定單個(gè)血小板上的PAIg，只要測(cè)定104甚至103個(gè)血小板，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上就能地得出PAIg的平均水平，因而用血量少，只要1 ml血液制備的血小板就足夠。流式細(xì)胞術(shù)還能同時(shí)測(cè)定其他一些反映血小板破壞的指標(biāo)，如PAIgG、PAIgM、C3等。血小板的生成與巨核細(xì)胞有關(guān)，全血法流式細(xì)胞術(shù)能像檢測(cè)網(wǎng)織紅細(xì)胞那樣，檢測(cè)分泌到循環(huán)中的“網(wǎng)織”血小板，來(lái)判斷血小板的生成。“

5.           血小板儲(chǔ)存與輸注：用P-選擇素（CD62）、CD63、GPⅡb/Ⅲa作分子標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)血庫(kù)中儲(chǔ)存血小板有時(shí)間依賴性的活化現(xiàn)象。儲(chǔ)存5天以上，40%～60%血小板表達(dá)活化標(biāo)志CD62。雖然其形態(tài)改變、乳酸脫氫酶泄漏以及β-TG的釋放也能反映其活化，但用CD62作為儲(chǔ)存血小板的質(zhì)量控制指標(biāo)?；罨难“逶谘h(huán)中的存活時(shí)間很短。若血小板在儲(chǔ)存時(shí)活化了，即使輸注也不能很好地提高患者止血能力。

6.           抗血栓藥物的監(jiān)測(cè)：活化血小板的檢測(cè)可以判斷患者是否需要抗血栓藥物治療，也可以監(jiān)測(cè)這些抗血栓藥物的作用，避免毒副反應(yīng)的發(fā)生。

7.           此外，全血法流式細(xì)胞術(shù)還可用于檢測(cè)血小板聚集，研究其免疫表型HPA-Ⅰa，測(cè)定嚴(yán)重血小板減少患者的血小板數(shù)目。

 

1.　全血中血小板更接近生理狀態(tài)。

2.       操作簡(jiǎn)便，減少由于操作造成的血小板狀態(tài)改變（如血小板活化試驗(yàn)）。

3.       同時(shí)檢測(cè)血小板的多個(gè)標(biāo)志物，結(jié)合FSC和SSC，評(píng)估多個(gè)參數(shù)，進(jìn)行定量分析。

4.       多采用血小板特異抗體CD41或CD61畫(huà)門(mén)，找出血小板，避免雜質(zhì)碎片的干擾。

5.       檢測(cè)血小板亞群靈敏度高。

6.       用血量少。

7.       無(wú)放射性污染。

 

1．抽取抗凝全血：檢測(cè)血小板功能時(shí)，應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)化的抽血規(guī)程。做血小板活化試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)盡量減少人為造成的血小板活化。

2．Falcon管中加取全血和適量直標(biāo)熒光抗體，充分混勻，室溫避光處反應(yīng)，通常放置15分鐘。

3．1%多聚甲醛固定樣本。

4．上機(jī)檢測(cè)

 

1.　陰性對(duì)照（Isotype Control）：非特異熒光的強(qiáng)弱取決于抗體濃度、單克隆熒光抗體特異性和純度，應(yīng)與試驗(yàn)管抗體相對(duì)應(yīng)。在多色分析時(shí)，同型對(duì)照應(yīng)與其它抗體同時(shí)使用，以避免補(bǔ)償造成的誤差。

2.            血小板體外活化試驗(yàn)：使用正常人活化標(biāo)本作為陽(yáng)性質(zhì)控。使用正常人未活化標(biāo)本作為陰性質(zhì)控。

3.            血小板自身抗體檢測(cè)：使用含有已知血小板抗體的血清與血小板孵育，作為陽(yáng)性質(zhì)控。使用不含血小板抗體的血清與血小板孵育，作為陰性質(zhì)控。

4.            血小板表面抗原缺失：如巨血小板癥血小板表面CD42a/CD42b缺失，血小板無(wú)力癥血小板表面gpIIb/IIIa，即CD41/CD61缺失或異常。使用正常人標(biāo)本做陽(yáng)性對(duì)照，抗體的同型對(duì)照做陰性對(duì)照。

 

1.　FSC-SSC點(diǎn)圖中找出血小板，缺點(diǎn)是血小板較小，不易通過(guò)大小將碎片或雜質(zhì)*分開(kāi)

 

2.       從CD41或CD61-SSC點(diǎn)圖中畫(huà)出血小板門(mén)，由于特異性高，可以有效地去除碎片和雜質(zhì)的干擾。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

流式細(xì)胞儀分析血小板的活化

 

血小板活化試驗(yàn)，對(duì)于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意義。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行多參數(shù)分析，可以特異靈敏地檢測(cè)血小板表面標(biāo)記，了解血小板的活化狀態(tài)和反應(yīng)性，并同時(shí)獲得更多關(guān)于血小板的信息。在疾病監(jiān)測(cè)、抗血小板治療病人的篩選及治療監(jiān)測(cè)、預(yù)測(cè)并發(fā)癥等方面有良好的應(yīng)用前景。

 

1.檢測(cè)血小板的反應(yīng)性。

2.了解血小板活化進(jìn)程。血小板先發(fā)生膜糖蛋白變化，然后是胞漿內(nèi)顆釋放到血小板外。

3.     同時(shí)檢測(cè)多種血小板表面標(biāo)志。

4.     高度靈敏。

5.     直接檢測(cè)血小板的多種標(biāo)志。

6.     使用全血，標(biāo)本量少。

7.     操作簡(jiǎn)便快捷，將血小板人工激活減至zui低。

 

1.       血小板特異性膜糖蛋白：血小板膜糖蛋白已被深入研究，下表顯示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在這些膜糖蛋白中，僅在血小板膜表面表達(dá)主要有GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa等有限的幾種，根據(jù)這些特異性糖蛋白制備的熒光單抗，能在全血中特異性地識(shí)別血小板。

表1　血小板膜上主要的糖蛋白及其功能

 

注：vWF血管性假血友病因子；Fb纖維蛋白原；Fn纖維粘連蛋白；

Vn體外粘連蛋；LRG富含亮氨酸家族

 

 

2.       活化血小板的標(biāo)志物：活化血小板與靜息血小板相比，其質(zhì)膜糖蛋白常發(fā)生顯著的變化，這些變化的糖蛋白便成為活化血小板的檢測(cè)標(biāo)志物,這些標(biāo)志物可分為三類：*類是血小板顆粒膜上的糖蛋白。血小板被激活時(shí)，其顆粒膜與質(zhì)膜發(fā)生融合，顆粒膜蛋白，如CD62、CD63，在質(zhì)膜上表達(dá)，成為活化血小板的分子標(biāo)志。第二類是血小板質(zhì)膜表面變化的糖蛋白表位。如GPⅡb/Ⅲa（CD41/61）的PAC1表位，它僅在血小板活化時(shí)才因構(gòu)象變化而顯露出來(lái)。因此，使用這個(gè)表位的熒光單抗，我們能更地在更早階段檢測(cè)到血小板的活化。另外，GPIV （CD36）雖然在靜息血小板上也表達(dá)，但活化血小板上表達(dá)量更高；GPIb-IX-V復(fù)合物（CD42）則相反，與靜息血小板相比，活化血小板上表達(dá)量顯著降低。第三類是出現(xiàn)在活化血小板上能與血小板表面受體相結(jié)合的一些抗原，包括纖維蛋白原，Xa因子和thrombospondin等。這些抗原在血小板表面的出現(xiàn)和消失在臨床檢測(cè)上也是有意義的。

3.       除檢測(cè)免疫性的分子標(biāo)志物外，流式細(xì)胞術(shù)還能檢測(cè)一些反映活化血小板功能的非免疫性指標(biāo)。如用Ca2+濃度敏感的熒光染料檢測(cè)胞內(nèi)Ca2+流，用能進(jìn)入血小板致密顆粒的熒光染料阿的平來(lái)檢測(cè)活化血小板的釋放功能等。

4.       單抗的選擇：與血小板有關(guān)的CD單抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b，CD42a-d，CD61（特異的泛血小板表面標(biāo)記，既與活化血小板結(jié)合，也與未活化血小板結(jié)合。CD61與CD41聯(lián)合，即為血小板表面gpⅡb/Ⅲa復(fù)合物），CD62，CD63 ，CD107a-b等，。活化血小板的檢測(cè)需選擇針對(duì)活化血小板標(biāo)志物的CD單抗。表2列舉了活化血小板檢測(cè)的一些代表性單抗。

表2　活化血小板CD單抗簡(jiǎn)介

 

 

 

三、操作步驟

1.      標(biāo)本采集：

（1）     枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管順序編號(hào)。

（2）     抽取靜脈血，采血管中注入2ml。

（3）     于10分鐘之內(nèi)完成血小板激活和染色步驟，操作時(shí)應(yīng)注意減少人工激活。

2.      血小板激活：

（1）     試管內(nèi)加入50mlADP（也可選用其他激活劑，如PMA、纖維蛋白、TRAP），450ml全血，輕輕搖勻。

（2）     室溫孵育5分鐘。

（3）     立即染色。

3.      熒光抗體染色：

（1）     Falcon管編號(hào)。

（2）     在對(duì)照管中加入同型對(duì)照、CD61、PAC－1和RGDS（PAC－1的阻斷劑）。

（3）     在試驗(yàn)管中加入CD62P、CD61和PAC－1。

（4）     在對(duì)照管和試驗(yàn)管中各加入未激活或激活的血標(biāo)本5ml。

（5）     輕輕混勻，室溫暗處孵育15-20分鐘。

（6）     各管中加入1ml冷的固定液 （2-8°C），充分混勻， 2-8°C陰暗處放置30分鐘。

（7）     24小時(shí)內(nèi)上機(jī)分析。

4.      結(jié)果分析：

在CD61 vs SSC點(diǎn)圖中設(shè)門(mén)找血小板群。 CD61 vs SSC 點(diǎn)圖顯示有三群，

CD61陽(yáng)性/低SSC一群主要由單個(gè)血小板組成，CD61陽(yáng)性/高SSC一群主要由黏附血小板的血細(xì)胞組成， CD61陽(yáng)性/散射光更低的一群主要由血小板來(lái)源的

碎片組成。由于在生理和病理情況下，血小板群和紅細(xì)胞群的大小、顆粒度會(huì)有交叉，因此，不建議使用FSC-SSC圖設(shè)門(mén)。    在CD61 vs SSC點(diǎn)圖中找出CD61 陽(yáng)性的血小板群 （單個(gè)血小板和黏附在WBC上的血小板），設(shè)門(mén)。

 

 

1.       采血時(shí)請(qǐng)用大號(hào)針管，抽出的前2ml血應(yīng)棄去不用。

2.       盡量避免標(biāo)本受到物理振動(dòng)。

3.       取血后10分鐘內(nèi)完成染色操作。

4.       在Falcon管中加血標(biāo)本5ml，管壁上不能有殘留血，未染色的部分會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。

5.       為了檢測(cè)和控制血小板體外激活，建議使用正常未受激活的血標(biāo)本平行做質(zhì)量控制。